Amino acid: thang pH, ion lưỡng cực và điểm đẳng điện
Chuyên đề Hóa học: amino acid là một thang các dạng theo pH, ion lưỡng cực, xếp pKa và điểm đẳng điện pI, điện di theo dấu điện tích, lập thể L và cấu hình S…
LUKATO AI · CHUYÊN ĐỀ HÓA HỌC 11 – 12
AMINO ACID · PEPTIDE · ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN
Amino acid:
thang pH,
ion lưỡng cực
và điểm đẳng điện
Một amino acid không phải một công thức cố định mà là một thang trạng thái : mỗi lần pH vượt qua một pKa, một nhóm mất H + và điện tích đổi một đơn vị. Chuyên đề dạy em xếp thang đó, tìm dạng trung hòa, lấy hai pKa kẹp để ra pI, rồi đọc một peptide như một chuỗi các điểm cắt .
- 1. Liệt kê nhóm ion hóa, xếp pKa tăng dần, tìm dạng trung hòa
- 2. pI là trung bình hai pKa kẹp; điện di và kết tủa đẳng điện
- 3. Peptide: điểm cắt enzyme, khối lượng mảnh, Edman và DNFB
5,97
pI của glycine, từ pKa 2,34 và 9,60
40.320 → 1
số cách xếp chuỗi còn khả dĩ khi thêm dữ kiện cắt
8 bí kíp
mỗi bí kíp có lí do và điểm gãy
01
Khái niệm lõi · Ion lưỡng cực, pKa và điểm đẳng điện
Amino acid là một thang các dạng, và pI là điểm điện tích thực bằng 0
Amino acid thiên nhiên là alpha-amino acid : nhóm amino và nhóm carboxyl cùng gắn vào carbon alpha (C alpha), cùng với một nhóm bên R. Trong nước chúng tồn tại chủ yếu ở dạng ion lưỡng cực H 3 N + -CHR-COO - . Mỗi nhóm có thể nhận hoặc nhường H + tùy pH, nên điện tích của phân tử là hàm của pH . Cả chuyên đề xoay quanh ba câu hỏi: ở pH này chất mang điện gì, pH nào làm điện tích thực bằng 0, và một chuỗi peptide được cắt và đọc ra sao.
Định nghĩa
Ion lưỡng cực
Phân tử mang đồng thời một điện tích dương (nhóm NH 3 + ) và một điện tích âm (nhóm COO - ) nhưng tổng bằng 0. Nhóm COOH là acid khá mạnh (pK a khoảng 2), nhóm NH 3 + là acid rất yếu (pK a khoảng 9 đến 10), nên proton nằm ở nitrogen chứ không ở oxygen. Dạng không điện tích H 2 N-CHR-COOH chỉ là phần rất nhỏ: với glycine trong nước, tỉ lệ ion lưỡng cực so với dạng không điện tích cỡ 10 5 trở lên.
Định nghĩa
pK a , điện tích thực và pI
Nhóm ion hóa ở pH nhỏ hơn pK a của nó thì chủ yếu còn H + ; ở pH lớn hơn thì chủ yếu đã mất H + ; khi pH bằng pK a thì đúng một nửa mất. Mỗi nhóm mất H + làm điện tích giảm 1 . Điểm đẳng điện pI là pH mà điện tích thực trung bình bằng 0: ở đó chất không đi về điện cực nào và thường tan kém nhất.
Khung tư duy: bốn bước từ công thức đến pI
1 · LIỆT KÊ NHÓM ION HÓA alpha-COOH, alpha-NH 3 + và nhóm bên nếu có. Ghi rõ nhóm nào là acid (trung hòa → âm) và nhóm nào là bazơ (NH 3 + dương → trung hòa).
2 · XẾP pKa TĂNG DẦN Nhóm có pK a nhỏ nhất mất H + trước. Mỗi bước mất H + tạo ra một dạng mới, điện tích giảm 1.
3 · TÌM DẠNG TRUNG HÒA Ở pH rất thấp điện tích bằng số nhóm bazơ. Đếm xuống từng bước cho tới khi điện tích bằng 0: đó là dạng trung hòa.
4 · LẤY HAI pKa KẸP pI bằng trung bình của pK a ngay trước và ngay sau dạng trung hòa. Rồi so pH với pI để biết dấu điện tích và chiều di chuyển.
Histidine: một nhóm bên làm thang dài thêm một nấc
Histidine có ba nhóm ion hóa nên có bốn dạng. Vòng imidazol ở nhóm bên có pK a khoảng 6, nằm giữa hai pK a kia, cho nên dạng trung hòa của histidine nằm ở giữa pK a của imidazol và pK a của alpha-NH 3 + . Vòng tròn vàng đánh dấu nhóm vừa mất H + ở mỗi bước.
Vuốt ngang để xem toàn bộ sơ đồ.
Tên dạng: H 3 A 2+ (điện tích +2), H 2 A + , HA (trung hòa), A - . Chữ A là phần còn lại sau khi nhường hết H + , chỉ số dưới là số H + còn giữ. Vòng imidazol vẽ với liên kết đôi cố định cho gọn; hai nitrogen của vòng có thể đổi vị trí proton nên cách vẽ này chỉ là một trong các cách viết tương đương.
Lập thể
L-amino acid và cấu hình S, R
Amino acid trong protein thuộc dãy L : trên chiếu Fischer (COOH ở trên, R ở dưới) nhóm amino nằm bên trái . Theo quy tắc CIP đa số là cấu hình S , riêng cysteine là R vì nhóm CH 2 SH có S nên xếp ưu tiên cao hơn COOH. Hình lập thể không đổi, chỉ thứ tự ưu tiên đổi.
Cấu trúc
Liên kết peptide phẳng
Nối nhóm COOH của amino acid này với nhóm NH 2 của amino acid kia, loại H 2 O, được liên kết amide gọi là liên kết peptide . Cặp electron của N lan sang C=O nên liên kết C-N có đặc tính liên kết đôi một phần: sáu nguyên tử quanh liên kết đó nằm trong một mặt phẳng, thường ở dạng trans.
Trình tự
Từ thành phần đến thứ tự
Thủy phân hoàn toàn chỉ cho thành phần . Muốn có thứ tự phải gắn nhãn đầu N (DNFB, Edman) hoặc cắt chuỗi bằng enzyme và hóa chất ở những vị trí xác định, rồi chồng lấp các mảnh của hai lần cắt khác nhau.
Lập thể: cùng một hình, hai tên gọi
Chọn amino acid và dãy L hay D. Đường cam nối ba nhóm ưu tiên cao nhất theo thứ tự 1, 2, 3. Nhóm ưu tiên thấp nhất (H) nằm trên nhánh ngang, tức hướng về phía người nhìn, nên chiều quay nhìn thấy phải đảo lại để ra cấu hình thật.
Hình tương tác: chiếu Fischer và cấu hình CIP TƯƠNG TÁC
Vuốt ngang để xem toàn bộ sơ đồ.
Amino acid: Dãy:
Chất
Thứ tự ưu tiên
Chiều 1 → 2 → 3
Cấu hình CIP
Mô hình: chiếu Fischer chuẩn (COOH trên, R dưới, nhóm trên nhánh ngang hướng về phía người nhìn). Cấu hình được tính từ vị trí các nhóm trên hình, rồi đối chiếu với kết quả của phần mềm hóa tin học cho cấu trúc khung tương ứng.
Liên kết peptide trên một đoạn glycyl-alanine
Vuốt ngang để xem toàn bộ sơ đồ.
Đoạn Gly-Ala ở dạng ion lưỡng cực. Vùng vàng là mặt phẳng amide; hai nhóm bên của hai carbon alpha nằm về hai phía của liên kết C-N (trans). Hai cấu trúc cộng hưởng ở bên phải là hai cách viết của cùng một nhóm amide, không phải hai chất.
Bảng pK a dùng trong cả chuyên đề
Một bộ số duy nhất, dùng nhất quán ở mọi phòng lab. Cột cuối là pI tính bằng trung bình hai pK a kẹp quanh dạng trung hòa (làm tròn nửa lên).
Amino acid
pK a thứ 1
pK a thứ 2
pK a thứ 3
pI
Glycine Gly
2,34 COOH
9,60 NH 3 +
5,97 trung bình pK a thứ 1 và 2
Alanine Ala
2,34 COOH
9,69 NH 3 +
6,02 trung bình pK a thứ 1 và 2
Aspartic acid Asp
1,88 COOH
3,65 COOH nhóm bên
9,60 NH 3 +
2,77 trung bình pK a thứ 1 và 2
Glutamic acid Glu
2,19 COOH
4,25 COOH nhóm bên
9,67 NH 3 +
3,22 trung bình pK a thứ 1 và 2
Lysine Lys
2,18 COOH
8,95 NH 3 +
10,53 NH 3 + nhóm bên
9,74 trung bình pK a thứ 2 và 3
Histidine His
1,82 COOH
6,00 imidazol
9,17 NH 3 +
7,59 trung bình pK a thứ 2 và 3
Arginine Arg
2,17 COOH
9,04 NH 3 +
12,48 guanidin
10,76 trung bình pK a thứ 2 và 3
Cysteine Cys
1,96 COOH
8,18 SH
10,28 NH 3 +
5,07 trung bình pK a thứ 1 và 2
Tyrosine Tyr
2,20 COOH
9,11 NH 3 +
10,07 OH phenol
5,66 trung bình pK a thứ 1 và 2
Vuốt ngang để xem toàn bộ bảng.
Bí kíp 1 Xếp pKa, đếm điện tích, tìm dạng trung hòa
Quy tắc. Liệt kê mọi nhóm ion hóa, xếp pK a từ nhỏ đến lớn; nhóm đứng đầu mất H + trước. Điện tích giảm đúng 1 sau mỗi nhóm; dạng có điện tích 0 là dạng trung hòa.
Vì sao đúng. Acid mạnh hơn (pK a nhỏ hơn) nhường H + ở pH thấp hơn, và mất một H + luôn làm điện tích giảm đúng một đơn vị dù nhóm đó là COOH (0 thành -1) hay NH 3 + (+1 thành 0).
Khi nào gãy. Hai pK a chênh nhau dưới khoảng 2 đơn vị (tyrosine: 9,11 và 10,07; lysine: 8,95 và 10,53) thì hai bước chồng lấn, dạng ở giữa không bao giờ chiếm 100%. Giá trị pK a còn đổi theo nguồn số liệu, dung môi và môi trường trong protein.
02
Phòng thí nghiệm 1 · Thang protonation
Kéo pH, xem từng nhóm mất H + và điện tích thực đổi dấu ở pI
Mỗi amino acid là một thang các dạng nối tiếp H 3 A 2+ , H 2 A + , HA, A - (số dạng bằng số nhóm ion hóa cộng 1). Phần mol của từng dạng được tính chính xác từ các cân bằng nối tiếp với pK a đã cho; điện tích thực là trung bình có trọng số của điện tích các dạng. Điểm Z = 0 chính là pI.
pI = (pK a trước + pK a sau) / 2
Phòng lab 1: chín amino acid trên thang pH TƯƠNG TÁC
Trái: cấu trúc của dạng chiếm ưu thế với các nhóm vừa mất H + bật quả cầu vàng bay ra khỏi nhóm đó. Phải trên: phần mol của từng dạng. Phải dưới: điện tích thực Z và điểm pI (hình thoi vàng).
Chọn amino acid:
Vuốt ngang để xem toàn bộ sơ đồ.
pH: -
pH
Dạng ưu thế
Điện tích Z
pI (công thức)
pI (Z = 0)
Công thức
Tổng phần mol
Mô hình: các pK a được xếp tăng dần và coi là các nấc cân bằng nối tiếp của một acid đa chức (chính xác theo [H + ], bỏ qua hệ số hoạt độ). Hình cấu trúc luôn ứng với dạng chiếm ưu thế; khi các pK a gần nhau (Tyr, Lys) thực tế còn lẫn nhiều dạng. pI công thức làm tròn nửa lên; pI theo Z = 0 là nghiệm số của hàm điện tích.
Bí kíp 2 pI là nơi Z đổi dấu, không phải pH bằng 7
Quy tắc. Điện tích thực Z(pH) luôn giảm khi pH tăng; nó cắt trục Z = 0 đúng một lần tại pI. pH nhỏ hơn pI thì Z dương, pH lớn hơn pI thì Z âm.
Vì sao đúng. Mỗi nhóm ion hóa mất H + chỉ theo một chiều khi pH tăng, và mỗi lần mất H + điện tích giảm, nên Z không thể tăng trở lại. Vị trí pI chỉ phụ thuộc pK a : acid như Asp có pI khoảng 2,77, bazơ như Arg khoảng 10,76.
Khi nào gãy. "Z = 0" là trung bình: tại pI vẫn có một ít phân tử mang điện dương và một ít mang điện âm, chỉ là hai phần cân bằng nhau. Với phân tử có rất nhiều nhóm (protein) Z có thể đạt 0 trên một dải pH rộng hơn.
03
Phòng thí nghiệm 2 · Điện di và điểm đẳng điện
Dấu của điện tích quyết định chiều đi; pI quyết định chỗ dừng
Đặt mẫu vào dải gel có đệm pH cố định rồi nối điện. Hạt mang điện dương bị kéo về catot (cực âm), hạt mang điện âm về anot (cực dương), hạt có điện tích thực bằng 0 thì đứng yên . Vì điện tích của amino acid đổi theo pH nên cùng một mẫu có thể đi theo chiều này hoặc chiều kia: muốn đoán chiều chỉ cần so pH của đệm với pI .
Điện di
Tách các chất theo điện tích
Trong mô hình định tính của bài này, tốc độ tỉ lệ với |Z| và bỏ qua kích thước phân tử. Mẫu Z gần 0 gần như không rời vạch xuất phát; mẫu |Z| lớn đi nhanh và xa. Trên thực tế, phân tử to bị gel cản nhiều hơn, nên chỉ so sánh được khi cùng loại phân tử hoặc cùng điều kiện gel.
Điểm đẳng điện
Vì sao pI hay là chỗ tan kém nhất
Ở pI điện tích thực trung bình bằng 0 nên các phân tử không đẩy nhau theo điện tích, và lớp nước bao quanh các nhóm tích điện mỏng đi; chúng dễ kết lại. Với protein đây là cách làm kết tủa đẳng điện. Với amino acid nhỏ, tính tan còn do mạng tinh thể và nước nên hiệu ứng yếu hơn, chỉ nên coi là xu hướng.
pH nhỏ hơn pI: Z dương → catot · pH lớn hơn pI: Z âm → anot
Phòng lab 2: điện di nhiều mẫu ở cùng một pH TƯƠNG TÁC
Chọn tối đa bốn mẫu (amino acid hoặc peptide của bài này), kéo pH của đệm, bấm Chạy điện di để hạt di chuyển. Đồ thị phía dưới vẽ Z theo pH của từng mẫu; hình thoi là pI, chấm là Z ở pH đang chọn.
Mẫu (chọn tối đa 4):
Vuốt ngang để xem toàn bộ sơ đồ.
pH của đệm: -
pH đệm
Số mẫu
pI của các mẫu
Điểm: 0 / 0
Mô hình: Z lấy từ các nấc cân bằng nối tiếp của bài 2; chiều đi theo dấu của Z (ngưỡng |Z| nhỏ hơn 0,05 coi là đứng yên); tốc độ tỉ lệ với |Z|, bỏ qua kích thước, hình dạng, dòng điện thẩm thấu và sự khuếch tán. Các pK a của peptide dùng một bộ giá trị cho đầu N (8,0), đầu C (3,1) và các nhóm bên: đó là giá trị gần đúng, trong chuỗi thật chúng đổi theo môi trường.
Bí kíp 3 Muốn biết chiều điện di, so pH của đệm với pI
Quy tắc. pH nhỏ hơn pI: mẫu mang điện dương, đi về catot. pH lớn hơn pI: mang điện âm, đi về anot. pH bằng pI: Z bằng 0, đứng yên. Hai mẫu cùng chiều thì mẫu có |Z| lớn hơn đi nhanh hơn (cùng kích thước).
Vì sao đúng. Z(pH) giảm dần theo pH (bí kíp 2) và bằng 0 đúng tại pI, nên dấu của Z hoàn toàn do pH đứng bên nào của pI. Ví dụ ở pH 6,0: Asp (pI 2,77) có Z = -1,00, Lys (pI 9,74) có Z = +1,00, Gly (pI 5,97) có Z = 0,00.
Khi nào gãy. Khi pH rất gần pI thì Z nhỏ và mẫu đi chậm đến mức khó thấy; khi hai mẫu khác kích thước thì so tốc độ theo Z không còn đáng tin; và phân tử có pI trùng pH đệm vẫn có thể bị cuốn đi do dòng điện thẩm thấu của gel.
04
Tự dự đoán trước khi xem đáp án
Bốn tình huống nhanh
Glycine trong dung dịch pH 1,0 (pK a 2,34 và 9,60). Điều gì đúng?
Lysine có pK a 2,18; 8,95; 10,53. Điểm đẳng điện của nó là giá trị nào?
Aspartic acid ở dung dịch đệm pH 7,0 trong điện trường. Nó sẽ làm gì?
Trypsin cắt sau Lys và Arg, trừ khi ngay sau đó là Pro. Đoạn Ala-Lys-Pro-Gly-Arg-Val bị trypsin cắt thành mấy mảnh?
05
Tư duy nguyên lí · Một câu hỏi về lí lẽ, không phải về con số
Vì sao pI là trung bình hai pK a , và vì sao amino acid là ion lưỡng cực?
Nguyên lí: người ta lấy pI của một amino acid bằng trung bình hai pK a kẹp dạng trung hòa, và nói rằng trong nước amino acid là ion lưỡng cực thay vì H 2 N-CHR-COOH. Hãy giải thích bằng khái niệm: (a) điều kiện nào định nghĩa pI và vì sao nó dẫn đến phép trung bình; (b) vì sao chỉ hai pK a xuất hiện; (c) vì sao proton nằm ở nitrogen chứ không ở oxygen trong nước.
Hãy tự phác ba ý trên giấy, rồi mở từng bước để đối chiếu.
Gợi ý 1 · Z bằng 0 nghĩa là gì?
Dạng trung hòa (điện tích 0) có mặt, nhưng Z là trung bình của các dạng. Dạng điện tích dương nhất gần dạng trung hòa và dạng điện tích âm nhất gần dạng trung hòa đóng góp ngược dấu. Khi nào hai đóng góp đó khử nhau?