Sổ cái nitơ: Kjeldahl, đạm, protein và chuẩn độ ngược
Mỗi nguyên tử nitơ thành NH4+, NH3 rồi bị bẫy trong acid: chuẩn độ ngược đếm phần dư, hệ số 6,25 đổi nitơ ra protein, và vì sao melamin lừa được phép đo.
LUKATO AI · CHUYÊN ĐỀ HÓA HỌC NÂNG CAO
HÓA 12 · PROTEIN · AMONIAC · CHUẨN ĐỘ NGƯỢC
Sổ cái nitơ : đếm đạm để biết protein
Không máy nào nhìn thẳng được protein trong một thìa sữa bột. Phương pháp Kjeldahl đi đường vòng: biến từng nguyên tử nitơ thành NH 4 + , đuổi ra thành NH 3 , nhốt vào acid rồi đếm phần acid còn dư. Nitơ là đơn vị tiền tệ; protein chỉ là con số quy đổi.
- Phân hủy · N thành NH 4 +
- Chưng cất · NH 3 bay sang bẫy
- Chuẩn độ ngược · đếm phần dư
- Hệ số · nitơ đổi ra protein
6,25
= 100 : 16, vì protein trung bình chứa 16 phần trăm nitơ
1 : 1 : 1
N trong mẫu : NH 3 bay ra : H + bị tiêu thụ
66,6
phần trăm khối lượng melamin là nitơ
4,16 g
protein "ảo" từ 1 g melamin khi nhân hệ số 6,25
01
Bản chất · nitơ là sổ cái
Đếm nitơ, suy ra protein
Protein là đại phân tử khổng lồ, mỗi loại một khác, rất khó đo trực tiếp. Nitơ thì đơn giản: một nguyên tố, đếm được bằng mol. Toàn bộ phương pháp Kjeldahl dựa trên một ý: ghi sổ nitơ thật chính xác, rồi đổi sang protein bằng một tỉ giá . Hiểu ý đó là hiểu được cả sức mạnh lẫn điểm mù của phép đo.
GỐC Protein mang nitơ trong nhóm amin, amid và liên kết peptit
PHÂN HỦY H 2 SO 4 đặc, nóng: C, H thành CO 2 , H 2 O; N thành NH 4 +
CHƯNG CẤT NaOH dư biến NH 4 + thành khí NH 3 , hơi nước cuốn sang bình hứng
BẪY NH 3 gặp acid đo trước, thành NH 4 + không bay hơi
ĐẾM Chuẩn độ acid còn dư, suy ra mol N, nhân hệ số ra protein
1. Vì sao nitơ là dấu vân tay của protein
Mỗi amino acid có ít nhất một nguyên tử nitơ trong nhóm amino (-NH 2 , hoặc -NH- trong vòng như ở prolin), và các amino acid nối với nhau qua liên kết peptit -CO-NH-. Tinh bột, đường, chất béo chỉ có C, H, O. Vì vậy trong phần lớn thực phẩm, nitơ gần như chỉ nằm trong protein, và lượng nitơ tỉ lệ với lượng protein.
Đo trên nhiều loại protein, người ta thấy nitơ chiếm trung bình khoảng 16 phần trăm khối lượng. Do đó 1 g nitơ ứng với 100 : 16 = 6,25 g protein . Đó là toàn bộ nguồn gốc của con số 6,25: một tỉ giá, không phải một định luật.
Điều ít tài liệu nói · 6,25 là lời khai về thành phần amino acid
Phần trăm nitơ của từng amino acid chênh nhau rất xa: leuxin C 6 H 13 NO 2 chỉ có 10,68 phần trăm N, glyxin C 2 H 5 NO 2 có 18,66, lysin C 6 H 14 N 2 O 2 có 19,16, còn arginin C 6 H 14 N 4 O 2 lên tới 32,16. Protein nào giàu amino acid nhiều nitơ (như glutamin có thêm nhóm amid, rất nhiều trong gluten lúa mì) thì phần trăm N cao hơn 16, nên hệ số phải nhỏ hơn 6,25. Trong chuỗi protein, mỗi gốc amino acid mất một phân tử nước khi tạo liên kết peptit, nên phần trăm N thực tế còn nhích lên một chút so với amino acid tự do.
Loại thực phẩm
Hệ số
Phần trăm N trong protein
Sữa và sản phẩm sữa
6,38
15,67
Thịt, trứng, ngô
6,25
16,00
Gạo
5,95
16,81
Đậu tương
5,71
17,51
Bột mì
5,70
17,54
Hệ số = 100 : (phần trăm N trong protein). Giá trị tùy loại thực phẩm và tùy tiêu chuẩn; hạt ngũ cốc nguyên hạt thường dùng 5,83. Trên thực tế rất nhiều phòng thí nghiệm vẫn dùng 6,25 cho mọi loại mẫu.
Lab 1 · Nitơ thật, nitơ giả và protein trên giấy TÍNH TOÁN THẬT
Protein của nguyên liệu gốc: 3,2 g/100 g
Pha thêm nước: 20 phần trăm
Lượng trộn vào: 150 mg/100 g
Protein thật
Protein theo Kjeldahl
Nitơ tổng đo được
Phần nitơ là nitơ giả
Protein bị thổi phồng
1 g chất trộn thành
Tính thật: phần trăm N theo khối lượng mol (urê CH 4 N 2 O 60,06 g/mol, 46,65 phần trăm N; melamin C 3 H 6 N 6 126,12 g/mol, 66,63 phần trăm N; amoni sulfat 132,13 g/mol, 21,20 phần trăm N). Giả định: mọi nitơ của chất trộn vào đều thành NH 4 + khi phân hủy, và phòng thí nghiệm dùng đúng hệ số của loại mẫu.
2. Điểm mù được xây sẵn
Kjeldahl không hỏi nitơ đến từ đâu. Bất kì chất nào có nitơ chuyển được thành NH 4 + đều được ghi vào sổ, rồi bị nhân với hệ số như thể nó là protein. Melamin C 3 H 6 N 6 là "chất làm giả lí tưởng" vì 66,6 phần trăm khối lượng của nó là nitơ, gấp hơn bốn lần protein: 1 g melamin được báo thành 4,16 g protein (hệ số 6,25), hay 4,25 g (hệ số 6,38). Pha sữa có 3,2 g protein/100 g với 20 phần trăm nước, protein thật tụt còn 2,56 g; chỉ cần khoảng 150 mg melamin cho mỗi 100 g là con số trên giấy trở lại 3,20 g. Đó chính là cơ chế khoa học của một vụ làm giả sữa từng gây ngộ độc thận hàng loạt ở trẻ nhỏ.
Giới hạn của mô hình
Lab 1 giả định mọi nitơ của chất trộn vào đều thành NH 4 + . Với urê và muối amoni điều này chắc chắn. Melamin có 3 nitơ trong nhóm amin và 3 nitơ trong vòng triazin; mô hình coi vòng này bị thủy phân hoàn toàn trong acid nóng nên cả 6 nitơ về NH 4 + . Đây là giả định của mô hình, không phải số liệu thu hồi đã kiểm chứng; dù vậy, việc làm giả chỉ có tác dụng chính vì phần lớn nitơ của melamin được ghi vào sổ. Mô hình cũng bỏ qua nitơ phi protein vốn có trong thực phẩm thật (amino acid tự do, nucleotit).
02
Phòng thí nghiệm chính
Chuỗi bảo toàn: N → NH 4 + → NH 3 → NH 4 + bị bẫy
Phương pháp Kjeldahl là một chuỗi bốn lần đổi dạng, và yêu cầu duy nhất là không nguyên tử nitơ nào rơi khỏi sổ . Mỗi bước tồn tại để giải quyết đúng một vấn đề của bước trước.
1. Phân hủy: đốt cháy bằng acid, giữ nguyên nitơ
Mẫu được đun với H 2 SO 4 đặc ở khoảng 360 đến 410 độ C. Acid sulfuric nóng là chất oxi hóa: cacbon và hydro bị oxi hóa thành CO 2 và H 2 O, còn S(+6) bị khử thành SO 2 . Kali sulfat được thêm vào để nâng nhiệt độ sôi của hỗn hợp (acid tinh khiết sôi thấp hơn, phân hủy sẽ chậm); muối đồng(II) sulfat, trước kia có thủy ngân hay selen, làm xúc tác. Dịch từ đen chuyển sang trong, xanh nhạt là dấu hiệu chất hữu cơ đã bị phá hết.
2C 2 H 5 NO 2 + 7H 2 SO 4 → 4CO 2 + 6SO 2 + (NH 4 ) 2 SO 4 + 8H 2 O Ví dụ với glyxin. Mỗi phân tử nhường 6 electron (hai C từ số oxi hóa trung bình +1 lên +4), mỗi SO 2 nhận 2 electron, nên 3 SO 2 cho mỗi glyxin.
Điều ít tài liệu nói · nitơ không đổi số oxi hóa, chỉ đổi chỗ đứng
Trong amin, amid và liên kết peptit, nitơ có số oxi hóa -3, đúng bằng số oxi hóa trong NH 4 + . Phân hủy không cần oxi hóa hay khử nitơ: chỉ cần phá khung cacbon quanh nó, rồi acid gắn H + vào. Đây là lí do sâu xa khiến nitơ nitrat (+5), nitrit (+3), nitro (+3) hay azo (-1) không tự thành NH 4 + : muốn đưa chúng về -3 phải có thêm bước khử. Môi trường oxi hóa mạnh như H 2 SO 4 đặc nóng không làm việc đó.
2. Kiềm hóa và chưng cất: biến ion thành khí
NH 4 + không bay hơi; muốn chuyển nitơ sang bình khác, phải biến nó thành NH 3 . Dịch phân hủy được pha loãng, thêm NaOH đặc, dư, rồi sục hơi nước để cuốn khí NH 3 qua ống sinh hàn.
H 2 SO 4 (dư) + 2NaOH → Na 2 SO 4 + 2H 2 O, rồi mới đến (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH → Na 2 SO 4 + 2NH 3 ↑ + 2H 2 O NH 4 + là acid liên hợp của amoniac, pK a khoảng 9,25 ở 25 độ C: ở pH 11 mới có 98,3 phần trăm ở dạng NH 3 , ở pH 12 là 99,82 phần trăm.
Điều ít tài liệu nói · gần như toàn bộ NaOH là để trả nợ acid
Dịch phân hủy chủ yếu vẫn là H 2 SO 4 . Ví dụ minh họa: 10 mL acid 98 phần trăm (khoảng 0,184 mol) cần khoảng 0,368 mol NaOH, tức gần 14,7 g, chỉ để trung hòa, trong khi NH 4 + của mẫu chỉ cỡ 1,4 mmol, ít hơn hàng trăm lần (một phần acid đã bị tiêu hao khi phân hủy, nhưng tỉ lệ vẫn là hàng trăm). Thiếu NaOH, dung dịch vẫn còn acid và không một phân tử NH 3 nào bay ra : kết quả bằng 0 mà không có dấu hiệu gì bất thường, trừ màu của dịch. Vì vậy người ta cho NaOH dư rõ rệt, thường nhìn màu của xúc tác đồng để biết môi trường đã kiềm: Cu 2+ kết tủa thành Cu(OH) 2 xanh, rồi khi nóng chuyển thành CuO đen nâu.
3. Hấp thụ: nhốt khí lại thành ion
Đầu ống sinh hàn nhúng dưới mặt một dung dịch acid đã biết chính xác lượng. NH 3 là base, gặp H + là bị proton hóa ngay: NH 3 + HCl → NH 4 Cl . Từ đây nitơ lại là ion, không bay đi được nữa. Sổ cái không đổi qua cả chuỗi: 1 mol N → 1 mol NH 4 + → 1 mol NH 3 → tiêu thụ đúng 1 mol H + .
Lab 2 · Đi theo nitơ qua bộ máy Kjeldahl MÔ HÌNH MINH HỌA
Nitơ trong mẫu: 1,50 mmol
Phân hủy hoàn toàn: 99,0 phần trăm
NH 3 thất thoát khi chưng cất: 1,0 phần trăm
NH 4 + sau phân hủy
NH 3 vào bẫy
H + còn dư trong bẫy
NaOH 0,1000 mol/L cần
Nitơ tìm được
Hiệu suất thu hồi
Bẫy cố định: 50,00 mL HCl 0,1000 mol/L, tức 5,000 mmol H + . Tính thật: bảo toàn mol theo tỉ lệ 1 : 1 : 1 và M(N) = 14,007 g/mol. Minh họa: hai thanh hiệu suất chỉ là cách mô tả mất mát, không phải giá trị đo của một quy trình cụ thể. Ngưỡng 95 và 99 phần trăm của lời nhận xét là mốc sư phạm; trên thực tế người ta kiểm tra thu hồi bằng một chất chuẩn có hàm lượng nitơ biết trước.
4. Chuẩn độ ngược: đếm phần dư để suy ra phần đã dùng
NH 3 là khí: chuẩn độ nó trực tiếp trong bình phân hủy là không thể, và bất kì thao tác nào để hở đều làm mất nitơ. Bẫy acid giải quyết điều đó, và đồng thời tạo ra một cây thước: ta biết chính xác đã cho bao nhiêu H + , chỉ cần đo xem còn lại bao nhiêu.
n(NH 3 ) = n(H + cho vào bẫy) - n(NaOH lúc điểm cuối) Phần trăm N = n(NH 3 ) · 14,007 : khối lượng mẫu; phần trăm protein = phần trăm N · hệ số. Hệ quả ngược trực giác: tốn càng nhiều NaOH, mẫu càng ít nitơ .
Điều ít tài liệu nói · điểm cuối đúng nằm ở pH khoảng 5,5, không phải 7
Lúc acid dư vừa hết, bình hứng không chứa nước trung tính mà chứa dung dịch NH 4 Cl, một acid yếu. pH lúc đó chỉ khoảng 5 đến 6. Muốn dừng đúng chỗ, phải dùng chỉ thị đổi màu trong vùng acid như đỏ methyl. Nếu dùng phenolphtalein (bắt đầu hồng ở pH khoảng 8,2), NaOH phải chuyển thêm một phần NH 4 + thành NH 3 rồi chỉ thị mới đổi màu. Bình hứng lúc đó là dung dịch đệm NH 4 + /NH 3 , pH bò lên rất chậm nên điểm cuối kéo dài, khó nhận ra. Phần NH 4 + bị chuẩn độ nhầm bằng 1 : (1 + 10 9,25 - pH ): dừng ở pH 8,2 mất khoảng 8 phần trăm nitơ, ở pH 8,6 khoảng 18, ở pH 9 khoảng 36. Kết quả thấp hơn đáng kể, khoảng 10 đến 40 phần trăm tùy chỗ dừng . Lab 3 cho thấy sau điểm cuối đúng, đường cong không nhảy tiếp mà đi vào vùng thoải; vạch xám chỉ là điểm hợp thức khi hết NH 4 + , không có bước nhảy nào để nhận ra nó.
Biến thể acid boric · bẫy không phải là thước
Nhiều phòng thí nghiệm hứng NH 3 vào acid boric thay cho acid mạnh: NH 3 + H 3 BO 3 → NH 4 + + H 2 BO 3 - . Acid boric quá yếu (pK a khoảng 9,24) nên chính nó không bị chuẩn độ trong vùng acid; người ta chuẩn độ thẳng ion H 2 BO 3 - vừa sinh ra bằng HCl chuẩn, với chỉ thị hỗn hợp đổi màu ở vùng acid nhẹ. Mỗi H 2 BO 3 - ứng với đúng một NH 3 . Vì vậy lượng acid boric không cần biết chính xác , chỉ cần dư; và cả phép đo chỉ cần một dung dịch chuẩn thay vì hai.
Lab 3 · Chuẩn độ ngược: bẫy, phần dư và đường cong pH PHÒNG THÍ NGHIỆM CHÍNH
Vạch vàng: acid dư vừa hết (điểm cuối đúng, dùng đỏ methyl). Vạch xám: điểm hợp thức khi NaOH đã chuyển hết NH 4 + thành NH 3 , không có bước nhảy để nhận ra. Dải màu là vùng đổi màu của chỉ thị, chỉ mang tính định tính.
Khối lượng mẫu: 0,50 g
Nitơ thật trong mẫu: 3,9 phần trăm
HCl trong bẫy: 25 mL
Nồng độ HCl: 0,10 mol/L
Nồng độ NaOH chuẩn: 0,10 mol/L
Thu hồi NH 3 : 99,0 phần trăm
H + cho vào bẫy
NH 3 đến bẫy
H + còn dư
NaOH lúc điểm cuối
Phần trăm N tính ra
Phần trăm protein
pH tại điểm cuối đúng
NH 3 vượt sức bẫy
Phần trăm N nếu dừng ở pH 8,2
Phần trăm N nếu dừng ở pH 9,0
Tính thật: sổ mol của chuẩn độ ngược; đường cong pH giải từ cân bằng điện tích [H + ] + [Na + ] + [NH 4 + ] = [OH - ] + [Cl - ] với pK a (NH 4 + ) = 9,25 và K w = 10 -14 . Giả định: bình hứng nhận thêm 50 mL nước cất ngưng tụ; bỏ qua hệ số hoạt độ và CO 2 hòa tan; phần NH 3 vượt sức bẫy vẫn ở trong bình lúc chuẩn độ (thực tế phần lớn đã bay mất).
Cái bẫy của cái bẫy
Khi NH 3 nhiều hơn H + trong bình hứng, dung dịch đã kiềm ngay từ đầu, buret đọc 0,00 mL, và phép tính chỉ ra đúng lượng acid đã cho: kết quả bị "kẹp trần" mà trông vẫn hợp lệ. Dấu hiệu nhận biết duy nhất là màu chỉ thị đã đổi trước khi nhỏ giọt NaOH nào. Quy tắc an toàn: chọn lượng mẫu và lượng acid sao cho phần dư còn đáng kể, ví dụ tốn khoảng 5 đến 40 mL NaOH trên buret 50 mL.
03
Trực giác trước, giải thích sau
Đoán trước khi xem lời giải
Chọn theo cảm giác trước, rồi đọc giải thích của từng lựa chọn. Các phương án sai đều có lí do riêng để sai.
1. Trộn cùng 1 g mỗi chất vào ba mẫu sữa giống nhau: urê, melamin, amoni sulfat. Mẫu nào bị Kjeldahl báo protein cao nhất?
2. Bẫy chứa 2,5 mmol HCl, nhưng mẫu giải phóng 3,0 mmol NH 3 . Kết quả chuẩn độ ngược sẽ thế nào?
3. Một bạn dùng phenolphtalein thay đỏ methyl khi chuẩn độ acid dư bằng NaOH. Kết quả nitơ sẽ thế nào?
4. Rau bón nhiều phân đạm nitrat chứa đáng kể ion NO 3 - . Kjeldahl thông thường sẽ ghi phần nitơ nitrat như thế nào?