SINH HỌC 12 · Hệ thống CRISPR/Cas9 và chỉnh sửa gene: địa chỉ, vết cắt, sửa vết đứt và giới hạn
Sinh học 12 · Bài khái niệm về CRISPR/Cas9: gốc miễn dịch của vi khuẩn, RNA dẫn bắt cặp và PAM NGG làm nên địa chỉ, HNH và RuvC cắt cách PAM ba cặp base…
SINH HỌC 12 · DI TRUYỀN PHÂN TỬ · CRISPR/Cas9 · LUKATO AI · BÀI KHÁI NIỆM
Tìm đúng địa chỉ, cắt đúng chỗ, rồi để tế bào sửa: hệ thống CRISPR/Cas9 và chỉnh sửa gene
Vì sao một RNA ngắn đủ để dẫn một enzyme đến đúng một chỗ trong hàng tỉ base? Và vì sao cắt DNA chưa phải là chỉnh sửa gene?
Bài này không luyện đề. Nó dựng một chuỗi khái niệm: CRISPR–Cas vốn là hệ miễn dịch thích nghi của vi khuẩn; RNA dẫn chọn địa chỉ bằng bắt cặp bổ sung và PAM là điều kiện bắt buộc; Cas9 cắt bằng hai domain, vết cắt cách PAM khoảng ba cặp base; kết quả chỉnh sửa do con đường tế bào sửa vết đứt quyết định, NHEJ hay HDR; các biến thể (nickase, dCas9, base editor, prime editor) giữ địa chỉ và đổi phần “kéo”; cuối cùng là ứng dụng và giới hạn: liệu pháp Casgevy, tác động ngoài đích, ranh giới giữa chỉnh sửa soma và dòng mầm. Mọi trình tự và con số trong các phòng thí nghiệm là ví dụ tự soạn.
6 SƠ ĐỒ TỰ DỰNG 2 PHÒNG THÍ NGHIỆM THUẦN KHÁI NIỆM 8 CÂU TRẮC NGHIỆM TỰ SOẠN
Về nguồn và ví dụ. Nguồn gốc vi khuẩn của CRISPR, vai trò crRNA và tracrRNA được đối chiếu với Wikipedia (CRISPR gene editing, Cas9) và ScienceDaily (công bố của Jinek và cộng sự, Science 2012); giải Nobel Hóa học 2020 với nobelprize.org và Wikipedia; PAM và sự phân biệt “của mình” với “của kẻ lạ” với Wikipedia (Protospacer adjacent motif) và AAT Bioquest; đoạn dẫn khoảng 20 nucleotide, vùng hạt, hai domain HNH và RuvC, vị trí vết cắt với Addgene, Wikipedia (Cas9) và bản tổng quan arXiv 1904.06375; NHEJ, HDR, nickase, dCas9, base editing, prime editing và biến thể độ chính xác cao với Addgene và Wikipedia (CRISPR gene editing, Prime editing, Base editing); bệnh hồng cầu liềm với MedlinePlus (gene HBB) và Wikipedia; Casgevy với thông cáo của FDA, Wikipedia, DrugBank và Patsnap; chỉnh sửa soma và dòng mầm với WHO (tuyên bố 2019 và khung quản trị tháng 7/2021). Các trình tự DNA, gene M, các vị trí thử và các con số trong phòng thí nghiệm là ví dụ tự soạn hư cấu ; mọi kết quả trong phòng thí nghiệm do chương trình tính ngay khi em bấm.
MỤC 1 · GỐC VI KHUẨN
CRISPR–Cas là hệ miễn dịch thích nghi của vi khuẩn: nhớ DNA của kẻ xâm nhập rồi cắt đúng DNA ấy
Phage, tức virus tấn công vi khuẩn, tiêm DNA của nó vào tế bào. Có vi khuẩn sống sót và lần sau nhận ra đúng kẻ đó. Công cụ chỉnh sửa gene hôm nay bắt nguồn từ cơ chế ấy, nên hiểu cơ chế trước, công cụ sau.
1.1 Dãy CRISPR là cuốn sổ ghi lại các lần bị xâm nhập
Ở nhiều vi khuẩn có một vùng DNA gồm các đoạn lặp giống nhau xen kẽ với các đoạn đệm (spacer) khác nhau. Mỗi đoạn đệm là một mảnh DNA của phage hay plasmid từng xâm nhập, được chèn vào dãy; cùng với các gene cas , chúng làm thành hệ miễn dịch thích nghi (Wikipedia: CRISPR gene editing; Wikipedia: Cas9). Hệ hoạt động qua ba giai đoạn: thu nhận đoạn đệm mới; biểu hiện , tức dãy được phiên mã và cắt thành các crRNA ngắn, mỗi crRNA mang một đoạn đệm; can thiệp , khi phức hợp tìm DNA khớp với đoạn đệm và cắt nó. Ở hệ Cas9 của Streptococcus pyogenes , crRNA kết hợp với một RNA thứ hai là tracrRNA để cùng dẫn Cas9 (Wikipedia: CRISPR gene editing; ScienceDaily về công bố của Jinek và cộng sự, 2012).
Vuốt ngang để xem hết sơ đồ
Hình 1. Ba giai đoạn của hệ CRISPR–Cas ở vi khuẩn: thu nhận đoạn đệm, tạo RNA dẫn và Cas9, can thiệp bằng cách cắt DNA phage có PAM (sơ đồ minh họa tự dựng, không theo tỉ lệ).
Điều rút ra. Trí nhớ nằm ở trình tự của đoạn đệm ; kẻ thực hiện cắt là Cas9 ; thứ nối hai việc ấy là bắt cặp bổ sung giữa RNA và DNA. Chính vì vậy cả hệ có thể lập trình: đổi đoạn đệm là đổi địa chỉ, còn Cas9 giữ nguyên.
1.2 Vì sao vi khuẩn không tự cắt mình
Đoạn đệm nằm ngay trong DNA của vi khuẩn và khớp hoàn toàn với chính nó, vậy mà vi khuẩn không bị cắt. Lí do là một trình tự ngắn gọi là PAM (protospacer adjacent motif): Cas9 chỉ cắt khi cạnh đoạn khớp có PAM. PAM có trên DNA của phage hay plasmid, nhưng các đoạn đệm trong dãy CRISPR không đi kèm PAM, nên Cas9 không cắt vào đó; nhờ vậy PAM giúp phân biệt “của mình” với “của kẻ lạ” (Wikipedia: Protospacer adjacent motif; AAT Bioquest).
GỐC TỰ NHIÊN hệ miễn dịch thích nghi của vi khuẩn
NÂNG CẤP NĂM 2012 hai RNA có thể nối thành một RNA dẫn đơn (Jinek và cộng sự, Science )
NOBEL HÓA HỌC 2020 Charpentier và Doudna, “cho việc phát triển một phương pháp chỉnh sửa bộ gene”
một nhà nghiên cứu thay đoạn dẫn 20 nucleotide trong RNA dẫn bằng một đoạn khác, giữ nguyên protein Cas9. Cái gì đổi, cái gì không đổi?
Giải thích. Địa chỉ đổi: Cas9 giờ đến những chỗ DNA khớp với đoạn dẫn mới (và có PAM cạnh đó). Cách cắt không đổi: vẫn là hai domain của cùng một protein, vết cắt vẫn cách PAM khoảng ba cặp base. Địa chỉ nằm trong RNA, “lưỡi kéo” nằm trong protein.
MỤC 2 · ĐỊA CHỈ
RNA dẫn chọn địa chỉ bằng bắt cặp bổ sung, còn PAM là điều kiện bắt buộc để Cas9 bám vào DNA
Hai thông tin cùng nhau xác định một địa chỉ: khoảng 20 nucleotide trong RNA dẫn và ba nucleotide NGG trên DNA. Thiếu một trong hai thì Cas9 không cắt.
2.1 Đọc bản đồ của một địa chỉ
Ở hệ SpCas9 phổ biến nhất, phần đặc hiệu của RNA dẫn dài khoảng 20 nucleotide. Nó bắt cặp bổ sung với một mạch của DNA, gọi là mạch đích (target strand). Mạch còn lại là mạch không đích (non-target strand); trên chính mạch này, liền sau đầu 3′ của đoạn có trình tự giống RNA dẫn, là PAM 5′-NGG-3′ , với N là base bất kì (Addgene; Wikipedia: Cas9; arXiv 1904.06375).
Vuốt ngang để xem hết sơ đồ
Hình 2. Phức hợp Cas9 – RNA dẫn trên DNA đích: đoạn dẫn bắt cặp với mạch đích, PAM nằm trên mạch không đích; vùng hạt là khoảng 10 nucleotide sát PAM (sơ đồ minh họa tự dựng).
địa chỉ = khoảng 20 nt khớp RNA dẫn + PAM NGG liền sau (trên mạch không đích) Cas9 gặp PAM trước, mở xoắn DNA từ đó và kiểm tra bắt cặp với RNA dẫn từ phía sát PAM ra xa
Vì kiểm tra bắt đầu từ phía PAM, những chỗ không khớp ở khoảng 10 nucleotide sát PAM (vùng hạt, seed) ngăn vết cắt, còn chỗ không khớp ở phần xa PAM thường được dung thứ (Addgene; Wikipedia: CRISPR gene editing). Điều này giải thích vì sao Cas9 đôi khi cắt cả những chỗ “gần giống” địa chỉ, như sẽ thấy ở Phòng A và mục 6.
2.2 Từ trình tự đích đến RNA dẫn: hai phép đổi
Thứ nhất, RNA dẫn giống mạch không đích, chỉ khác là T được thay bằng U. Thứ hai, nó bắt cặp với mạch đích , tức mạch kia. Hai mệnh đề này là hai mặt của cùng một sự thật; nhầm “giống mạch có PAM” thành “bắt cặp với mạch có PAM” là lỗi hay gặp.
mạch không đích: 5′-GTCAACGTCATCGAAGCTAC- AGG -3′
RNA dẫn: 5′-GUCAACGUCAUCGAAGCUAC-3′
mạch đích: 3′-CAGTTGCAGTAGCTTCGATG- TCC -5′ ví dụ tự soạn: RNA dẫn không chứa PAM; PAM AGG nằm trên mạch không đích
PHÒNG A Tìm địa chỉ và thử lệch cặp
Dải DNA 46 cặp base dưới đây là ví dụ tự soạn hư cấu . Chương trình quét mạch không đích tìm mọi vị trí NGG. Chọn một vị trí thử: RNA dẫn là 20 nucleotide ngay trước ba base của vị trí ấy. Sau đó bật các ô số để làm vị trí lạ khác RNA dẫn ở những nucleotide đã chọn (1 là xa PAM nhất, 20 là sát PAM nhất) và xem Cas9 phản ứng thế nào. Phần phán đoán dùng một mô hình định tính đơn giản của bài: vùng hạt là 10 nucleotide sát PAM (vị trí 11 đến 20); phần “Cách đọc” là nhận xét của người soạn.
Chọn vị trí thử
Mẫu có sẵn
Bật hoặc tắt chỗ lệch ở từng vị trí của RNA dẫn
Vuốt ngang để xem hết sơ đồ
Điều rút ra. Có hai điều kiện độc lập. PAM quyết định Cas9 có bám vào hay không: khớp 20/20 mà không có NGG thì vẫn không cắt. Mức khớp ở vùng hạt quyết định Cas9 có mở xoắn và cắt hay không: lệch ở vùng hạt chặn cắt, lệch xa PAM thường bị bỏ qua. Cũng vì vậy một vị trí “gần giống” đích có thể bị cắt nhầm, đó là tác động ngoài đích (off-target).
MỤC 3 · VẾT CẮT
Cas9 cắt bằng hai domain: HNH cắt mạch đích, RuvC cắt mạch không đích, vết cắt cách PAM ba cặp base
Khi RNA dẫn đã bắt cặp đủ với mạch đích, Cas9 đổi hình và hai “lưỡi cắt” bắt đầu làm việc. Mỗi lưỡi lo một mạch.
3.1 Hai lưỡi cắt, hai mạch
Domain HNH cắt mạch đích, tức mạch bắt cặp với RNA dẫn; domain RuvC cắt mạch không đích. Vết cắt xảy ra khoảng 3 cặp base về phía đầu 5′ tính từ PAM, và các đầu DNA sau khi cắt chủ yếu là đầu phẳng (Wikipedia: Cas9; arXiv 1904.06375; bản tóm tắt công bố của Jinek và cộng sự; Addgene ghi khoảng 3 đến 4 nucleotide, nên con số chính xác tùy cách tính và tùy tài liệu).
Vuốt ngang để xem hết sơ đồ
Hình 3. Vết cắt giữa vị trí 17 và 18 của đoạn đích, cách PAM ba cặp base; hàng dưới cho thấy hai đầu phẳng sau khi cắt (trình tự là ví dụ tự soạn).
Điều rút ra. Có hai mạch nên cần hai lưỡi cắt; thiếu một lưỡi thì chỉ một mạch bị cắt. Nhớ điều này để hiểu các biến thể ở mục 5.
3.2 Cắt chưa phải là chỉnh sửa
Hai vết cắt trên hai mạch tạo ra một đứt gãy kép (DSB). Cas9 không “viết” thêm gì vào DNA; nó chỉ làm DNA đứt đúng chỗ. Phần còn lại là việc của tế bào, vì đứt gãy kép là tổn thương mà tế bào phải sửa. Hình thức sửa như thế nào, và có DNA mẫu hay không, quyết định gene cuối cùng ra sao. Đó là nội dung mục 4.
một RNA dẫn bắt cặp hoàn hảo với 20 nucleotide của mạch đích, nhưng ba nucleotide liền sau trên mạch không đích là TAC. Cas9 có cắt không? Nếu ba nucleotide ấy là TGG thì vết cắt nằm ở đâu?
Giải thích. Với TAC thì không cắt, vì SpCas9 cần PAM NGG; khớp 20/20 mà thiếu PAM vẫn không đủ. Với TGG thì có PAM: vết cắt nằm giữa nucleotide thứ 17 và thứ 18 của đoạn 20 nt, tức cách PAM ba cặp base.
MỤC 4 · SỬA VẾT ĐỨT
Sau vết cắt, tế bào quyết định: NHEJ để lại indel làm hỏng gene, HDR cần donor để sửa chính xác
Hai nhóm nghiên cứu cùng dùng một RNA dẫn có thể nhận được hai kết quả rất khác nhau. Khác ở chỗ nào? Ở việc họ có đưa DNA mẫu vào cùng Cas9 hay không.
4.1 Hai con đường sửa đứt gãy kép
NHEJ (nối đầu không tương đồng) nối hai đầu đứt lại với nhau: nhanh, không cần khuôn, nhưng dễ sai, thường để lại vài nucleotide bị mất hoặc thêm vào (indel) ở chỗ nối. Nếu indel nằm trong vùng mã hóa và số nucleotide mất hoặc thêm không chia hết cho 3 thì khung đọc bị lệch, thường dẫn đến mã kết thúc sớm và gene bị vô hiệu (knockout). HDR (sửa chữa nhờ tương đồng) dùng một DNA mẫu (donor) mang trình tự mong muốn cùng hai nhánh tương đồng với hai bên vết cắt làm khuôn: chính xác, nhưng kém hiệu quả hơn nhiều, thường dưới 10 % số alen bị biến đổi (Wikipedia: CRISPR gene editing; Addgene).
Vuốt ngang để xem hết sơ đồ
Hình 4. Sơ đồ rẽ nhánh sau vết cắt: không có donor thì NHEJ và indel, có donor thì HDR sửa theo khuôn (sơ đồ minh họa tự dựng).
4.2 Đọc hậu quả ở mức protein
Mã di truyền đọc theo từng bộ ba nucleotide liên tiếp. Mất hoặc thêm một số nucleotide chia hết cho 3 chỉ làm mất hoặc thêm vài axit amin, còn khung đọc từ đó về sau vẫn giữ. Mất hoặc thêm một số không chia hết cho 3 làm mọi bộ ba phía sau vết cắt bị đọc lệch, và chuỗi thường chạm mã kết thúc sớm. Một thay thế đơn lẻ như GAG thành GTG chỉ đổi đúng một axit amin (Glu thành Val). Phòng B cho em tự đặt vết cắt và chọn kiểu sửa rồi xem protein.
PHÒNG B Sau khi cắt: tế bào sửa, protein ra sao
Gene M hư cấu dài 60 nucleotide mã hóa 19 axit amin rồi mã kết thúc. Alen của bệnh nhân mang đột biến thay thế GAG thành GTG ở bộ ba thứ 7 (Glu thành Val), mô phỏng kiểu đột biến của bệnh hồng cầu liềm. Cas9 cắt tại vị trí em chọn. Chọn NHEJ để xem một kiểu indel cụ thể (thực tế mỗi tế bào có thể nhận một kiểu khác nhau) hoặc HDR với một loại donor. Chương trình đọc lại bằng bảng mã di truyền chuẩn. Phần “Cách đọc” là nhận xét của người soạn.
Con đường sửa
Mẫu có sẵn
Kiểu indel
Số nucleotide mất hoặc thêm 1
Vết cắt nằm sau nucleotide số 9
Loại donor
Vuốt ngang để xem hết sơ đồ
Điều rút ra. Cas9 chỉ quyết định chỗ đứt; con đường sửa và khuôn mẫu quyết định kết quả. Muốn vô hiệu một gene thì NHEJ thường là đủ. Muốn đổi chính xác một base theo ý muốn thì cần khuôn (HDR) hoặc công cụ khác (mục 5).
một nhóm muốn tắt hẳn một gene gây bệnh trong tế bào; một nhóm khác muốn đổi đúng một base GTG thành GAG. Mỗi nhóm nên dựa vào con đường sửa nào, và nhóm nào cần chuẩn bị thêm DNA mẫu?
Giải thích. Nhóm tắt gene có thể dựa vào NHEJ: indel làm lệch khung đủ để vô hiệu gene, không cần khuôn. Nhóm đổi một base cần khuôn nên phải chuẩn bị donor mang GAG (HDR), hoặc dùng công cụ không cần đứt gãy kép ở mục 5. Chỉ đưa Cas9 và RNA dẫn thì kết quả chủ yếu là indel ngẫu nhiên chứ không phải thay thế chính xác.
MỤC 5 · NGOÀI VIỆC CẮT