🧬 Sinh học · Công nghệ gene · Đếm đoạn cắt của enzyme giới hạn và đọc điện di, chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng gene kháng sinh, và nhân bản vô tính khác sinh sản hữu tính ở nhân và ti thể
Chuyên đề hệ thống công nghệ gene cho học sinh lớp 12, thường gặp khi học về enzyme giới hạn, điện di, DNA tái tổ hợp, nhân bản vô tính và sinh vật chuyển…
LUKATO AI · SINH HỌC · CÔNG NGHỆ GENE
Sinh học · Enzyme giới hạn và điện di · DNA tái tổ hợp · Nhân bản và sinh vật chuyển gene
Công nghệ gene là một bài toán đếm : enzyme cắt ở đâu, đoạn nào chạy xa, tế bào nào sống sót, gene nào được truyền
Chuyên đề này gom công nghệ gene về ba câu hỏi đếm được, thường gặp khi học về enzyme giới hạn, điện di, plasmid, nhân bản vô tính và sinh vật chuyển gene. Thứ nhất, cắt DNA và đọc gel : n vết cắt cho n + 1 đoạn trên phân tử thẳng nhưng chỉ n đoạn trên phân tử vòng, đoạn nhỏ chạy xa giếng hơn đoạn lớn, và một đột biến làm mất vị trí cắt sẽ gộp hai vạch thành một vạch lớn hơn. Thứ hai, tạo DNA tái tổ hợp và chọn lọc : enzyme giới hạn cắt vector và gene, ligase nối lại, nhưng phần lớn tế bào nhận chỉ mang vector tự đóng vòng, nên phải chọn bằng gene kháng sinh, và gene bị chèn vào giữa sẽ bị phá hỏng nên chính chỗ hỏng ấy giúp nhận ra tế bào cần tìm. Thứ ba, truyền gene : nhân bản vô tính chuyển nhân cho con giống hệt cá thể cho nhân về nhân tế bào, ti thể lại đến từ trứng, còn sinh sản hữu tính chia gene theo xác suất. Ba mô hình minh họa do bài tự đặt để bạn tự thử từng bước.
Cùng vị trí cắt, thẳng và vòng cho số đoạn khác nhau DNA 12 kb, enzyme X cắt ở 4 kb và 9 kb: dạng thẳng cho 3 đoạn (4, 5, 3 kb), dạng vòng chỉ cho 2 đoạn (5, 7 kb); thêm enzyme Y cắt ở 6 kb thì X cùng Y cho 4 đoạn nhưng chỉ 3 vạch, vì hai đoạn 3 kb dồn một vạch đậm
Chỗ hỏng của gene đánh dấu là dấu hiệu nhận ra tái tổ hợp Trong 2000 tế bào, biến nạp 5% và một nửa số đó nhận plasmid tái tổ hợp: enzyme P cắt vào gene tetR, đĩa Amp có 100 khuẩn lạc nhưng đĩa Amp cùng Tet chỉ 50; 50 khuẩn lạc thiếu là tái tổ hợp
Nhân bản giống hệt, hữu tính chỉ giống theo xác suất Con nhân bản từ D (dị hợp 4 locus) giống D 100% về nhân; con sinh sản hữu tính D × E chỉ giống D ở cả 4 locus với xác suất 6,25% và mang ít nhất một gene chuyển T với xác suất 50%
01
Khái niệm lõi
Từ một phân tử DNA đến cả công nghệ gene: cắt, đọc, nối, chọn, truyền
Công nghệ gene là tập hợp các kĩ thuật làm việc trực tiếp trên DNA: cắt ra từng đoạn, đọc độ dài các đoạn, nối đoạn mới vào, đưa vào tế bào và theo dõi gene ấy được truyền thế nào. Điều làm cho nó học được thành một hệ thống là cả chuỗi kĩ thuật này đều trả lời bằng những con số đếm được : bao nhiêu vết cắt, bao nhiêu đoạn, bao nhiêu vạch, bao nhiêu khuẩn lạc, bao nhiêu phần trăm con mang gene. Bài chia thành ba tầng. Tầng thứ nhất là cắt và đọc : enzyme giới hạn nhận biết một trình tự ngắn và cắt tại đó, điện di xếp các đoạn theo kích thước. Tầng thứ hai là nối và chọn : ligase nối đoạn gene vào thể truyền thành DNA tái tổ hợp, rồi chọn tế bào đã nhận bằng gene kháng sinh. Tầng thứ ba là truyền : gene đi theo nhân bản vô tính hoặc theo sinh sản hữu tính, và hai đường ấy khác nhau về bản chất.
1 · Cắt Enzyme giới hạn cắt tại trình tự nhận biết, cho các đoạn có đầu dính hoặc đầu bằng
2 · Đọc Điện di: đoạn nhỏ chạy xa, đoạn lớn chạy ngắn; vạch đếm kích thước đoạn
3 · Nối Ligase nối gene vào thể truyền thành DNA tái tổ hợp
4 · Chọn Biến nạp vào tế bào nhận rồi chọn bằng gene kháng sinh; gene bị chèn phá là dấu hiệu
5 · Truyền Nhân bản: nhân giống hệt cá thể cho; hữu tính: gene chia theo xác suất
Mô hình thứ nhất là cắt và điện di. Một phân tử DNA dài L (kb, một nghìn cặp base) bị enzyme cắt tại n vị trí khác nhau. Nếu phân tử thẳng, n vết cắt tách thành n + 1 đoạn; nếu phân tử vòng, vết cắt đầu tiên chỉ mở vòng thành đoạn thẳng nên n vết cắt cho n đoạn (n ít nhất 1). Các đoạn cộng lại luôn bằng L. Khi hai enzyme cùng cắt, số vết cắt là số vị trí khác nhau trong hợp hai tập vị trí:
\begin{gathered}N_{t}=n+1\\ N_{v}=n\ \ (n\ge 1)\\ \sum_{i}s_{i}=L\end{gathered}
Trong gel agarose, DNA tích điện âm chạy về cực dương, gel như một cái rây nên đoạn càng nhỏ càng chạy xa giếng. Quãng đường d gần như là hàm tuyến tính của lôga kích thước s. Mô hình của bài đặt d (mm) theo s (kb) như dòng thứ hai bên dưới, chỉ là một hàm đơn điệu giảm để minh họa:
\begin{gathered}d\approx a-b\,\log_{10}s\\ d=70-55\log_{10}s\end{gathered}
Mô hình thứ hai là tạo DNA tái tổ hợp và chọn lọc. Trong một lần biến nạp có T tế bào nhận được plasmid, trong đó Q tế bào nhận plasmid tái tổ hợp (mang gene đã chèn) và phần còn lại nhận plasmid tự đóng vòng. Một tế bào mọc trên đĩa khi có đủ gene kháng mà đĩa yêu cầu. Gọi C là số khuẩn lạc trên đĩa; chỉ số dưới k chạy qua ba loại tế bào (không nhận plasmid, tự đóng vòng, tái tổ hợp), N là số tế bào của loại ấy, và I bằng 1 nếu loại ấy đủ gene kháng cho đĩa và bằng 0 nếu thiếu. Với 2000 tế bào, tỉ lệ biến nạp t phần trăm và r chục phần trăm trong đó là tái tổ hợp (mô hình của bài):
\begin{gathered}C=\sum_{k}N_{k}I_{k}\\ T=20\,t\\ Q=2\,t\,r\end{gathered}
Mô hình thứ ba là truyền gene. Tại mỗi locus, gọi g là số alen quan tâm (0, 1 hoặc 2) của một cá thể; giao tử mang alen ấy với xác suất p = g/2. Đời con của D và E có o alen (0, 1 hoặc 2) với xác suất P₀, P₁, P₂ như dưới đây; còn con nhân bản có nhân của D nên giữ nguyên g của D ở mọi locus:
\begin{gathered}p=\dfrac{g}{2}\\ P_{0}=(1-p_{D})(1-p_{E})\\ P_{2}=p_{D}\,p_{E}\\ P_{1}=1-P_{0}-P_{2}\end{gathered}
Ba nguyên lí cần nhớ (1) Số đoạn do số vết cắt và dạng phân tử: thẳng n + 1, vòng n; điện di xếp đoạn theo kích thước (đoạn nhỏ chạy xa), các đoạn cùng cỡ dồn một vạch, và số vạch là số cỡ khác nhau chứ không phải số đoạn; mất một vị trí cắt (đột biến điểm) gộp hai đoạn thành một đoạn lớn, và thể dị hợp cho vạch của cả hai alen. (2) DNA tái tổ hợp cần cả enzyme giới hạn lẫn ligase; phần lớn tế bào nhận chỉ mang vector tự đóng vòng, nên phải chọn bằng gene đánh dấu; khi enzyme cắt vào giữa một gene kháng sinh, gene đó hỏng ở plasmid tái tổ hợp, và tế bào mọc trên đĩa có một thuốc nhưng không mọc trên đĩa có thuốc kia chính là tái tổ hợp. (3) Nhân bản vô tính chuyển nhân cho con có nhân giống hệt cá thể cho nhân, ti thể từ trứng, mẹ mang thai không đóng góp gene; sinh sản hữu tính chia gene theo xác suất, nên một cá thể chuyển gene dị hợp chỉ truyền gene cho nửa số giao tử; liệu pháp tế bào soma, kể cả tế bào gốc, không đổi gene của dòng mầm nên không làm mất alen bệnh ở đời sau.
02
Hệ thống khái niệm
Tám khái niệm cần phân biệt
Enzyme giới hạn, đầu dính và ligase Enzyme giới hạn là enzyme của vi khuẩn nhận biết một trình tự ngắn, thường 4 đến 8 cặp nucleotide, và cắt liên kết phosphodiester tại vị trí cố định trong trình tự đó. Trình tự nhận biết thường đối xứng: đọc theo chiều 5′ đến 3′ trên hai mạch cho cùng một chuỗi, như GAATTC của EcoRI. Enzyme cắt so le để lại hai đầu mạch đơn nhô ra, gọi là đầu dính; enzyme cắt thẳng cho đầu bằng. Hai đoạn DNA từ hai nguồn khác nhau, cùng cắt bằng một enzyme, có đầu dính bổ sung nhau nên bắt cặp được; ligase là enzyme nối, hàn các liên kết phosphodiester còn hở. Enzyme giới hạn cắt đặc hiệu tại trình tự của nó, không cắt ngẫu nhiên, nên số vết cắt trên một phân tử là số lần trình tự ấy xuất hiện.
Đếm đoạn: thẳng n + 1, vòng n Phân tử thẳng có hai đầu tự do, nên mỗi vết cắt thêm đúng một đoạn: n vết cắt cho n + 1 đoạn. Phân tử vòng không có đầu, vết cắt đầu tiên chỉ mở vòng, nên n vết cắt cho n đoạn. Với DNA 12 kb và enzyme X cắt ở 4 kb và 9 kb: dạng thẳng cho 3 đoạn (4, 5, 3 kb), dạng vòng cho 2 đoạn (5, 7 kb). Một vết cắt trên vòng cho một đoạn thẳng 12 kb, không vết cắt nào thì vòng vẫn nguyên. Hai enzyme cùng cắt thì lấy hợp các vị trí: X ở 4 và 9 kb cùng Y ở 6 kb cho vết cắt 4, 6, 9 và 4 đoạn (4, 2, 3, 3 kb); hai enzyme cắt trùng một vị trí chỉ tính một vết cắt.
Điện di: đoạn nhỏ chạy xa DNA mang điện âm nhờ các nhóm phosphate nên chạy về cực dương; gel agarose là mạng lưới nhỏ cản đoạn dài nhiều hơn đoạn ngắn, nên đoạn càng nhỏ càng chạy xa giếng. Quãng đường gần như là hàm tuyến tính của lôga kích thước, vì thế một thang chuẩn (các đoạn đã biết cỡ chạy cùng gel) giúp đọc cỡ đoạn lạ. Mỗi cỡ đoạn tạo một vạch; vạch càng đậm khi càng nhiều DNA, và trong các bài toán quen thuộc quy ước độ đậm tỉ lệ với số đoạn cùng cỡ. Trong mô hình của bài, đoạn 3 kb chạy 43,8 mm, đoạn 5 kb chạy 31,6 mm và đoạn 12 kb chạy 10,6 mm. Số vạch là số cỡ khác nhau: ba đoạn 4 kb chỉ cho một vạch rất đậm, không phải ba vạch.
Bản đồ cắt và hình gel: đi xuôi và đi ngược Đi xuôi: biết vị trí vết cắt thì tính được các đoạn rồi vẽ gel. Đi ngược: biết các đoạn thì dựng lại bản đồ, với hai quy tắc kiểm tra là các đoạn cộng lại bằng L và số đoạn bằng n + 1 (thẳng) hoặc n (vòng). Cắt riêng một enzyme thường chưa đủ để định vị: DNA thẳng 12 kb mà X cho 5 và 7 kb thì vết cắt ở 5 hoặc ở 7 kb tính từ một đầu, chưa biết đầu nào. Thêm Y cho 8 và 4 kb: có bốn bản đồ khả dĩ; hai bản đồ (X ở 5, Y ở 8) và (X ở 7, Y ở 4) cùng cho X + Y các đoạn 3, 4, 5 kb, còn hai bản đồ (5, 4) và (7, 8) cùng cho 1, 4, 7 kb. Vậy gel của X + Y loại được hai bản đồ nhưng không phân biệt hai bản đồ lật gương nhau; muốn phân biệt phải có thêm thông tin về một đầu của phân tử.
RFLP và dấu vân tay DNA Đột biến điểm làm mất (hoặc tạo thêm) một vị trí nhận biết thì đổi số và kích thước đoạn giới hạn: đó là đa hình chiều dài đoạn giới hạn (RFLP). Ví dụ alen A có hai vị trí X ở 4 và 9 kb nên cho 4, 5, 3 kb; alen a mất vị trí ở 4 kb nên chỉ còn cắt ở 9 kb và cho 9 và 3 kb: hai đoạn 4 và 5 gộp thành đoạn 9. Người đồng hợp AA có các vạch 5, 4, 3, đồng hợp aa có 9, 3, còn dị hợp Aa có vạch của cả hai alen: 9, 5, 4, 3 kb. Cách đọc này dùng trong chẩn đoán một số bệnh và trong xác định quan hệ huyết thống: mỗi vạch của con phải có ở bố hoặc ở mẹ, vì con nhận một alen từ mỗi bên; vạch không có ở cả bố lẫn mẹ cho thấy quan hệ huyết thống khó đúng. Dấu vân tay DNA là mẫu vạch riêng của từng người, trừ sinh đôi cùng trứng.
Thể truyền, DNA tái tổ hợp, biến nạp và gene đánh dấu Thể truyền (vector) thường là plasmid: phân tử DNA vòng nhỏ nằm ngoài nhiễm sắc thể của vi khuẩn, tự nhân đôi độc lập, có điểm khởi đầu nhân đôi, vị trí cắt cho enzyme giới hạn và gene đánh dấu, thường là gene kháng kháng sinh. Cắt plasmid và DNA nguồn bằng cùng enzyme, trộn với ligase thì được DNA tái tổ hợp; nhưng phần lớn plasmid chỉ tự đóng vòng lại mà không mang gene. Biến nạp là đưa DNA vào tế bào nhận (thường E. coli đã xử lí để dễ thu nhận DNA, như dùng CaCl₂ kèm sốc nhiệt hoặc xung điện); chỉ một phần nhỏ tế bào nhận được. Trong mô hình của bài, plasmid 6 kb có gene kháng ampicillin (ampR) và gene kháng tetracycline (tetR), gene cần chuyển dài 2 kb, nên plasmid tái tổ hợp dài 8 kb; trong 2000 tế bào biến nạp 5% là 100 tế bào.
Chọn lọc và phá gene đánh dấu Môi trường có kháng sinh chỉ cho tế bào có gene kháng tương ứng mọc, nên tế bào không nhận plasmid bị loại. Nhưng tế bào mang plasmid tự đóng vòng cũng mọc, nên đĩa kháng sinh chưa nói tế bào nào mang gene chuyển. Mẹo là chọn enzyme cắt vào giữa một gene kháng: ở plasmid tái tổ hợp gene ấy bị đoạn chèn ngắt quãng nên mất chức năng. Enzyme P cắt vào tetR: tế bào tái tổ hợp mọc trên đĩa Amp, không mọc trên đĩa Tet; tế bào tự đóng vòng mọc trên cả hai. Với 2000 tế bào, biến nạp 5%, một nửa tái tổ hợp: đĩa Amp có 100 khuẩn lạc, đĩa Tet có 50, đĩa Amp cùng Tet có 50, vậy 50 khuẩn lạc mọc trên Amp mà không mọc trên Tet là tái tổ hợp. Nếu enzyme cắt ngoài hai gene (enzyme R), cả hai loại cùng kháng cả hai thuốc nên không phân biệt được.
Nhân bản vô tính chuyển nhân Nhân bản vô tính ở động vật: lấy nhân từ tế bào soma của cá thể cho D, chuyển vào tế bào trứng đã loại bỏ nhân của một cá thể khác, kích thích phát triển thành phôi, rồi cấy phôi vào tử cung một con cái mang thai. Con sinh ra có nhân giống hệt D (vì cùng lấy nguyên bộ nhiễm sắc thể từ nhân D); DNA ti thể đến từ tế bào chất của trứng; con cái mang thai chỉ nuôi phôi, không đóng góp gene nào. Vì vậy con nhân bản không giống D về mọi mặt: ti thể có thể khác, kiểu hình còn chịu ảnh hưởng môi trường và biểu hiện gene. Cừu Dolly, ra đời năm 1996, là động vật có vú đầu tiên được nhân bản từ tế bào soma trưởng thành.
Sinh vật chuyển gene và liệu pháp tế bào gốc Sinh vật chuyển gene mang một gene ngoại lai đưa vào hợp tử hoặc phôi sớm. Cá thể sáng lập thường chỉ mang gene chuyển T ở một trong hai nhiễm sắc thể tương đồng (kiểu T/−). Giao phối tuân theo quy luật Mendel: T/− × −/− cho nửa số con mang T, còn T/− × T/− cho 1/4 T/T, 1/2 T/− và 1/4 −/−; trong mô hình của bài, D là T/− còn E không mang T thì xác suất con có T là 50%, và khi cả hai là T/− thì xác suất con T/T là 25%. Nhân bản từ chính cá thể T/− cho mọi con đều T/−. Liệu pháp tế bào gốc cấy tế bào gốc để tạo mô thay thế, hợp với bệnh do thiếu loại tế bào ấy (như đái tháo đường type 1 do mất tế bào β của tuyến tụy), chưa hợp với bệnh chủ yếu do kháng hormone như đái tháo đường type 2, và không đổi gene của dòng mầm nên alen bệnh vẫn có thể truyền cho đời sau.